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Les rejets d’eaux usées dans l’environnement aquatique sont une cause importante de pollutions chroniques. Les eaux usées parviennent en partie dans les cours d’eau via les exutoires des conduites d’eaux claires qui servent, en temps normal, à rejeter des eaux de pluie. Les canalisations mal connectées, cassés ou bouchées engendrent des dysfonctionnements sur le réseau d’évacuation et des déversements d’eaux usées dans les eaux claires. Les informations sur ces canalisations et leur emplacement ont été perdues au fil du temps et de la succession des travaux de transformations et de construction. Il en résulte une difficulté de repérer les points des pollutions dans les cours d’eau.
À elle seule, la Ville de Lausanne compte plus de 750 exutoires d’eaux claires, répertoriés dans les cours d’eau à ce jour sur son territoire (fig. 1). Il est donc nécessaire de disposer d’une méthode fiable pour identifier clairement, rapidement et à moindre coût la présence d’eaux usées dans les exutoires d’eaux claires. Sur la base des expériences menées en interne dans les laboratoires impliqués dans cette étude, il a été constaté que les approches «classiques» de l’identification des eaux usées présentent des limites importantes lorsqu’elles sont appliquées à un contexte ouvert et complexe tel que celui des rejets dans l’environnement [2]. L’analyse de l’ammonium et du phosphate a d’emblée été écartée car elle ne permet pas de cibler suffisamment les pollutions aux eaux usées. Les autres méthodes classiques les plus courantes pour l’identification de ces pollutions, sont l’analyse microbiologique sur gélose pour l’identification de germes indicatrices de contamination fécale (fig. 2) et l’analyse des micropolluants par LC-MS/MS axée sur les molécules provenant des eaux usées domestiques. Parmi ces molécules, citons l’édulcorant artificiel acésulfame K comme traceur dans l’urine et les excréments humains, ainsi que les bisphénols comme traceurs dans les eaux usées domestiques et industrielles [3].
La principale limite de la technique microbiologique classique est l’impossibilité de distinguer les matières fécales humaines de celles des animaux – donc provenant de l’environnement. Etant donné que pour les techniques de chimie analytique, l’analyse d’une seule molécule ne suffit pas pour détecter la présence des eaux usées avec certitude, il faudrait envisager l’analyse de plusieurs molécules. De plus, la contamination en zones urbaines par des urines ou des déchets risque de simuler la présence des eaux usées dans les conduites d’eaux claires. L’approche LC-MS/MS nécessite une interprétation par un expert qui doit avoir la capacité d’interpréter les concentrations d’un grand nombre de substances et leur pertinence pour définir s’il s’agit d’eaux usées.
L’objectif de cette étude est donc d’évaluer une nouvelle approche, basée sur la biologie moléculaire (PCR et PCR quantitative; voir encadré), pour identifier la présence de rejets d’eaux usées dans les eaux claires et qui puisse surmonter les limites des méthodes classiques. Cette approche consiste à surveiller la présence d’un gène spécifique aux bactéries de la flore intestinale humaine, donc exclusivement associé aux fèces humaines et aux eaux usées contaminées par celles-ci.
Afin d’identifier avec précision les échantillons d’eaux usées, il est important de se concentrer sur les marqueurs de biologie moléculaire qui minimisent le risque de résultats faussement positifs ou faussement négatifs. Sur la base des études publiées précédemment, l’analyse de la présence de bactéries appartenant au genre Bacteroides est extrêmement fiable pour l’identification des échantillons de fèces humaines. Ces bactéries font partie des bactéries anaérobies les plus fréquentes de la flore intestinale humaine et sont très spécifiques de leur hôte. La recherche de gènes spécifiques aux Bacteroides d’origine humaine permet de distinguer les fèces humaines de celles des autres mammifères [4]. Malheureusement, les Bacteroides se caractérisent par une très courte persistance dans l’environnement, ce qui les rend difficile à détecter par les méthodes classiques de culture sur gélose. Toutefois, leur ADN persiste plus longtemps, ce qui en fait de bons traceurs moléculaires d’excrément humains [5]. Dès lors, des méthodes de quantification par PCR (qPCR) ont été développées. Parmi ces traceurs moléculaires les plus prometteurs, on trouve l’analyse du gène HF183, propre au Bacteroides et qui a d’ailleurs montré une très bonne persistance dans
l’environnement [6].
De plus, il est possible de différencier les échantillons concentrés des échantillons faiblement concentrés, c’est-à -dire de distinguer les sources de rejet d’eaux usées des contaminations environnementales. A cet effet, une étude comparative de la proportion de marqueurs spécifiques des Bacteroides humains à la population bactérienne, ainsi qu’une comparaison entre la présence de gènes spécifiques et d’un gène exprimé de manière constitutive dans toutes les bactéries sont menées.
Afin de mettre au point une méthode d’analyse robuste, 17 échantillons véritablement positifs ont été prélevés. Il s’agissait d’échantillons prélevés à des endroits où il y a eu contact avec des eaux usées, comme les canalisations d’égouts et les cours d’eau urbains préalablement identifié comme pollué. Dix échantillons réellement négatifs ont également été prélevés à des endroits où il était certain qu’il n’y avait pas de contact avec l’eau utilisée par l’homme, tels que des cours d’eau forestiers, des fontaines de sources naturelles ou des captages d’eau potable.
Les échantillons réels ont été prélevés dans les exutoires d’eaux claires, préalablement sélectionnés selon une méthodologie. Les détails de cette méthode de présélection sont disponibles dans une publication [7].
Les échantillons ont été prélevés dans des bouteilles stériles, quand il y avait un débit d’eau suffisant pour obtenir le volume nécessaire aux analyses, c’est-à -dire 200 ml (fig. 4a). Pour les rejets à faible débit ou absence de débit, un récipient en verre préalablement stérilisé, a été laissé sur place maximum 24 h (fig. 4b).
L’ADN a été extrait des filtres après filtration des échantillons à l’aide d’un kit commercial DNeasy PowerSoil (Qiagen), après remise en suspension dans une solution tampon. La quantification par qPCR, a été effectuée en utilisant une courbe standard créée par l’amplification de copies connues du gène HF183. Chaque standard a été utilisé pour calculer la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) de la qPCR. La LOD de tous les gènes était de 10 copies/réaction et la LOQ de 100 copies/réaction.
En parallèle, à titre comparatif, la présence de bactéries indicatrices de contamination fécale dans les échantillons a été analysée par les méthodes de microbiologie classiques selon les protocoles pour l’eau potable.
Au niveau du seuil de validation des résultats, la méthodologie moléculaire permet de fixer un seuil de présence/absence basé sur les valeurs de LOQ. Cela rend les résultats très facilement interprétables. En effet, si on observe la présence du marqueur moléculaire HF183 au-delà du LOQ, ceci indique la présence de fèces humaines et donc des eaux usées. Cela diffère des deux autres techniques citées, où la valeur numérique du résultat doit être interprétée au cas par cas. Afin de valider l’approche qPCR, les résultats ont été comparés aux résultats obtenus par les méthodes microbiologiques classiques et par l’analyse des micropolluants par LC-MS/MS.
L’analyse chimique est basée sur la quantification d’une série de micropolluants typiques des eaux usées au moyen de la chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse triple quadripôle (LC-MS/MS). L’analyse LC-MS/MS comprenait la quantification de 33 composés qui couvrent un large spectre de types d’eaux usées, de celles contenantes de l’urine et des excréments, par le biais de l’analyse d’édulcorants, à celles contenants de l’eau usée d’origine industrielle par le biais de l’analyse d’anticorrosifs et de bisphénols (tab. 1).
| Technique | Laboratoire  | Matériels | Paramètres |
| Microbiologie classique | A, B | Filtration sur membrane et incubation sur gélose spécifique | Dénombrement des entérocoques fécaux et Escherichia coli |
| Analyse des micropolluants | A | LC-MS/MS (Acquity 1 UPLC® Class, TQ-S micro, Waters) | Quantification de 4 édulcorants, 2 anticorrosifs, 3 pesticides à usage domestique, 20 produits pharmaceutiques, caféine, bisphénol A et S |
| Biologie moléculaire | C | 7500 Fast Real Time PCR System, Applied Biosystems™ | Analyse du gène HF183 |
Tab. 1 Techniques évaluées pour la recherche et l’identification des points de rejet des eaux usées. Laboratoires: A: Laboratoire du Service de l’eau, Ville de Lausanne; B: Scitec Research SA, Lausanne; C: Institut de microbiologie (IM), Haute Ecole spécialisées du Tessin, Bellinzona.
Il s’agissait tout d’abord de définir un seuil permettant d’identifier les échantillons contaminés par les eaux usées de ceux qui étaient négatifs. Ce seuil a été défini sur la base de notre expérience et des résultats de littérature (tab. 2; [8]).
|  | Microbiologie classique  | Analyse des micropolluants  | Biologie moléculaire  |
|  + | ≥ 200 UFC/100 ml | Pollué* | Présence |
|  – | < 200 UFC/100 ml | Propre* | Absence |
Tab. 2 Valeurs seuils pour déclarer si un échantillon d’eau provient d’eaux usées humaines (+) ou non (-). Le seuil pour la méthode classique est basé sur la littérature [8]. UFC: unité formant colonie;* Interprétation par l’opérateur en fonction du type de composé détecté et de la concentration.
Au total, 111 échantillons ont été analysés, en considérant également les échantillons de test. Pour chaque méthode, il a été possible d’évaluer la sensibilité (taux de faux positifs) et la spécificité (taux de faux négatifs).
Les trois techniques ont identifié correctement tous les échantillons vrais positifs. En revanche seules les méthodes de qPCR et d’analyse de micropolluants ont révélé un résultat correct pour tous les échantillons vrais négatifs.
Pour ces mêmes échantillons, les bactéries indicatrices de contaminations fécales ont été détectées avec les méthodes microbiologiques classiques, indiquant une contamination fécale non humaine (par exemple un animal), ce qui correspond à des faux positifs à hauteur de 21% des échantillons vrais négatifs (fig. 5). En raison de ce nombre élevé de faux positifs, la technique de microbiologie classique n’est pas considérée comme suffisamment fiable.
L’analyse de micropolluants a identifié 49,5% des échantillons comme étant contaminés, alors que 31% ont été identifiés comme contaminés par la méthode de biologie moléculaire. Cet écart s’explique d’abord par les différents seuils de détection des deux méthodes, avec un seuil de détection plus bas pour l’analyse de micropolluants. De plus, l’analyse de micropolluants permet d’identifier des contaminations d’eaux usées autres que celles contenants des excréments humains, telles que les eaux usées en provenance d’industries ou de buanderies. Néanmoins, tous les échantillons identifiés comme contaminés par la biologie moléculaire ont été également identifiés comme contaminés par l’analyse de micropolluants, ce qui montre une parfaite corrélation entre les deux approches. En ce qui concerne l’analyse par microbiologie classique, le pourcentage élevé d’échantillons positifs (65%) s’explique par le taux élevé de faux positifs propre à cette technique.
L’analyse des résultats et des observations pratiques et expérimentales permet d’identifier les avantages et les inconvénients propres à chacune des techniques employées (tab. 3).
| Technique | Avantages | Inconvénients |
| Microbiologie classique |
|
|
| Analyse des micropolluants   |
|
|
| Biologie moléculaire |
|
|
Tab. 3 Les avantages et les inconvénients propres à chacune des techniques employées.
L’identification des pollutions aux eaux usées dans des eaux claires est cruciale pour une bonne gestion de l’environnement, en particulier dans un environnement urbain. Les approches les plus courantes sont les approches microbiologiques classiques basées sur la recherche des bactéries indicatrices de contamination fécale, et les approches analytiques reposant sur l’analyse des micropolluants traceurs des eaux usées. Ces approches ont des limites importantes, ce qui nous a poussés à explorer une nouvelle approche basée sur une technique de biologie moléculaire. Ceci non seulement dans le but de surmonter les limites des autres techniques mais aussi afin de fournir une analyse facilement interprétable, relativement rapide et peu coûteuse.
Cette étude a déterminé que l’analyse qPCR pour le gène HF183 est une technique appropriée et alternative notamment à l’analyse de micropolluants, pour identifier avec certitude les échantillons d’eaux usées d’origine humaine, et donc de confirmer la contamination d’un cours d’eau ou d’un rejet par de l’eau usée. Parmi toutes les techniques, l’analyse du gène HF183 est la seule qui permet d’identifier sans ambiguïté la présence d’excréments d’origine humaine. L’analyse chimique par LC-MS/MS reste une technique de choix pour les très faibles volumes d’échantillons et pour les rejets industriels qui ne sont pas contaminés avec des eaux usées d’origine humaine.
[1] Willey, L.M. et al. (2018): La réaction de polymérisation en chaine par polymérase amplifie l’ADN ciblé. Microbiologie de Prescott (5e éd.). De Boeck
[2] McCancead, W. et al. (2018): Contaminants of Emerging Concern as novel groundwater tracers for delineating wastewater impacts in urban and peri-urban areas. Water Research 146: 118–133
[3] Roslev, P.; Bukh, A.S. (2011): State of the art molecular markers for fecal pollution source tracking in water. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89: 1341–1355
[4] Avelar, K.E. et al. (1998): Influence of stress conditions on Bacteroides fragilis survival and protein profiles. Zentralbl. Bakteriol. 287: 399–409
[5] Kreader, C. A. (1998): Persistence of PCR-detectable Bacteroides distasonis from human feces in river water. Appl. Environ. Microbiol. 64(10): 4103–4105
[6] Seurinck, S. et al. (2005): Detection and quantification of the human-specific HF183 Bacteroides 16S rRNA genetic marker with real-time PCR for assessment of human faecal pollution in freshwater. Environ. Microbiol. 7(2): 249–259
[7] Khajehnouri, F. et al. (2022): Stop aux égouts dans les cours d’eau. Aqua & Gas 4/22: 76–83
[8] Case, R.J. et al. (2007): Use of 16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for microbial ecology studies. Appl. Environ. Microbiol. 73(1): 278–288
Le terme «réaction en chaîne par polymérase» (PCR) a été utilisé pour la première fois il y a plus de 30 ans. Cette technique s’est rapidement imposée dans le monde entier comme l’outil de choix pour l’amplification enzymatique spécifique de l’ADN – le support de l’information génétique. L’invention de la PCR a donné un grand élan à la recherche dans divers domaines de la biologie, et cette technologie a contribué de manière significative au niveau actuel des connaissances humaines dans de nombreux domaines de recherche.
Le concept général de la PCR repose sur une amorce d’ADN spécifique – le modèle choisi par l’expérimentateur –, une ADN polymérase – l’enzyme qui va amplifier l’ADN –, des nucléotides et une matrice d’ADN issue de l’échantillon. L’analyse par PCR requiert la répétition d’une série de réactions, qu’on appelle des cycles. Chaque cycle comprend 3 étapes qui se succèdent avec précision dans une machine appelée thermocycleur.
Dans la première étape, la double hélice d’ADN «s’ouvre» en ADN simple brin en portant la température à 95 °C environ (dénaturation). Ensuite, la température est abaissée autour de 50 °C de sorte que les amorces puissent s’aligner et se lier à l’ADN de part et d’autre de la séquence visée si celle-ci est présente (hybridation). Finalement, la température est augmentée généralement entre 68 °C et 72 °C pour que l’ADN polymérase puisse prolonger les amorces et synthétiser des copies de l’ADN cible en utilisant des nucléotides (extension) ([1]; fig. 3).
À la fin de l’extension, le cycle recommence, ce qui permet d’amplifier de manière exponentielle les séquences d’ADN sélectionnées par les amorces. Le choix d’une bonne amorce est donc décisif. En effet, le but de l’analyse est de déterminer si l’amorce choisie par l’expérimentateur trouve une complémentarité dans la matrice issue de l’échantillon. Si c’est le cas, la séquence sera amplifiée plusieurs fois pour permettre la détection et la quantification. S’il n’y a pas de correspondance entre l’amorce et la matrice d’ADN, il n’y a aura pas de possibilité d’amplification.
La quantification des séquences correspondantes à l’amorce choisie est faite par PCR dite «quantitative» (qPCR), où un élément fluorescent est introduit dans la réaction et est amplifié proportionnellement au nombre de sites compatibles avec l’amorce. Ceci permet de savoir non seulement si «oui» ou «non» un site compatible à l’amorce est bien présent sur l’échantillon, mais aussi combien de fois.
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