Plateforme pour l’eau, le gaz et la chaleur
Les influences anthropogéniques, avec leurs corollaires tels que le changement climatique et la pollution, ont un impact important sur le plancton et les services écosystémiques des lacs (par exemple, eau potable, anoxie, rendement des poissons) [1]. Dans les lacs, le phytoplancton constitue la base du réseau alimentaire pélagique et joue un rôle déterminant dans la qualité de l'eau. Pour évaluer la santé de l'écosystème lacustre, il est indispensable de surveiller la communauté planctonique. En Suisse, le plancton est régulièrement surveillé depuis des décennies, car les autorités sont tenues de contrôler la qualité de l'eau [2].
Traditionnellement, les échantillons de plancton sont comptés manuellement au microscope. Cette approche prend du temps et la qualité de l'analyse varie en fonction de l'expérience du spécialiste en taxonomie, ce qui peut conduire à des classifications différentes. De plus, les résultats ne sont généralement pas compréhensibles ni vérifiables [3-6]. La disponibilité décroissante de spécialistes formés ainsi que les restrictions budgétaires rendent nécessaires de nouvelles technologies pour satisfaire à l'obligation de contrôle. L'approche la plus prometteuse pour le comptage et la classification des organismes repose sur des techniques d'imagerie automatisées [7]. Nous mettons ici en lumière les avantages et les limites de l'imagerie automatisée pour la surveillance du plancton dans les lacs.
Pour le plancton d'eau douce, on s'intéresse généralement aux particules de 1 μm à 1 cm [3]. Actuellement, la FlowCam et l'Aquascope [3, 7] sont les seuls instruments d'imagerie automatisés capables de capturer le plancton d'eau douce dans la gamme de tailles souhaitée (FlowCam : 2-1000 μm [8], Aquascope : 10-1000 μm [3]). La FlowCam a été initialement développée pour l'étude du plancton marin, puis commercialisée et appartient désormais à Yokogawa Electric Corporation [8]. Elle combine l'imagerie numérique, la cytométrie en flux et la microscopie en un seul appareil. Pour imager les particules avec une résolution maximale, il faut utiliser le bon grossissement ainsi que la cellule à circulation et la seringue appropriées. Chaque cellule à circulation a des réglages spécifiques et un diamètre maximal de particule déterminé par le côté le plus court de la cellule à circulation. Par conséquent, un échantillon doit être filtré en fonction de sa taille, ce qui peut entraîner le blocage de particules dans le filtre/tamis et/ou la destruction de colonies ou de cellules individuelles. Il n'existe pas de classificateur open source pour l'apprentissage automatique (ML) pour les images générées par la FlowCam. L'utilisation de la FlowCam ne sera pas abordée plus en détail dans cet article.
L'Aquascope est un microscope sous-marin à grossissement double, il a été conçu comme un instrument de surveillance in situ automatisé [3]. Pour permettre une utilisation en laboratoire, les auteurs ont développé un adaptateur de laboratoire à écoulement. L'Aquascope image des objets translucides situés entre la source de lumière et l'objectif à une fréquence pouvant atteindre dix images par seconde et avec une plage de détection de ~10 à 150 μm (grossissement 5 fois, taille de pixel = 0,62 μm) et de ~100 à 1 cm (grossissement 0,5 fois, taille de pixel = 6,2 μm). Chaque image contient plusieurs régions d'intérêt (ROI) qui sont enregistrées individuellement. Merz et al. [3] ont montré que le nombre de ROI par seconde (ROI/sec) est un indicateur fiable des densités cellulaires [3], et même lorsqu'elles sont utilisées avec le système de flux, les ROI/sec évoluent avec la densité cellulaire, comme on pourrait s'y attendre d'une série de dilution (Fig. 1). Par rapport à la FlowCam, il n'est pas nécessaire de filtrer l'échantillon ni de changer d'objectif ou de cellules à circulation, car les deux grossissements fonctionnent en parallèle. Des caractéristiques de taille, de forme et de couleur peuvent être extraites de chaque ROI [9, 10]. En outre, un classificateur open source pour l'apprentissage automatique a été développé [11, 12], qui peut distinguer 32 groupes taxonomiques à un grossissement de 0,5 (surtout le mésozooplancton et les grandes colonies de phytoplancton) et 79 à un grossissement de 5 (surtout le phytoplancton et le microzooplancton).
L'objectif de ce travail était d'analyser les opportunités ainsi que les difficultés des développements futurs des systèmes d'imagerie automatisés, en particulier l'Aquascope, pour la surveillance de routine du plancton. Pour ce faire, l'Aquascope a été testé en laboratoire avec des échantillons de plancton intégrés provenant de différents lacs. Bien qu'ils ne soient pas complètement identiques, il s'agit du même modèle d'Aquascope que celui installé dans le Greifensee.
Tous les échantillons ont été imagés à une cadence d'une image par seconde et à un débit d'environ 0,2 l/min pendant cinq minutes. La chambre entière a été vidée et remplie à nouveau pour le passage suivant afin d'obtenir des répliques expérimentales. Ensuite, les caractéristiques morphologiques de toutes les ROI ont été extraites et chaque image a été classée à l'aide du classificateur ML. La description détaillée des méthodes et des résultats est consignée dans le rapport complet dans les archives BioRxiv [13].
Pour obtenir un échantillon représentatif de la biodiversité de la communauté lacustre avec l'Aquascope, il faut d'abord estimer un effort d'échantillonnage raisonnable. Pour comprendre l'ampleur de cet effort, il est possible d'étudier les courbes d'accumulation des taxons. Cette expérience a été réalisée avec un échantillon de plancton provenant d'un lac (le Greifensee). Dans les courbes d'accumulation des taxons, on peut voir (Fig. 2) que le nombre de groupes taxonomiques reconnus dans le grossissement 0,5x se stabilise après cinq répétitions de cinq minutes chacune (1657 ROI). En revanche, le grossissement x5 bénéficie d'un plus grand nombre de réplicats, notamment parce que le volume d'imagerie est beaucoup plus petit avec le grossissement x5. En l'espace de dix réplicats (1270 ROI), on ne constate pas de saturation des groupes taxonomiques reconnus, comme c'est le cas avec le grossissement 0,5 fois. A l'avenir, ces courbes pourront optimiser l'effort d'échantillonnage pour différents lacs, saisons et machines.
Pour estimer avec précision l'abondance des taxons, il faut des outils d'apprentissage automatique capables de classer les nombreuses images produites par l'Aquascope. Un classificateur open source fonctionnant bien est déjà utilisé pour l'Aquascope au Greifensee, mais ses performances sur des images provenant d'un autre appareil utilisé dans le laboratoire sont inconnues. Cette information est cruciale pour déterminer l'effort de développement nécessaire pour adapter le classificateur à différents lacs, applications et instruments.
Pour tester le classificateur dans des conditions de laboratoire, un échantillon d'eau intégré a été utilisé dans le Greifensee. On a enregistré 1270 ROI à un grossissement de 5 fois et 3433 ROI à un grossissement de 0,5 fois. Ensuite, chaque ROI a été catégorisé à l'aide du classificateur et toutes les images ont été vérifiées manuellement afin de calculer la précision.
Les résultats montrent que la précision du classificateur est de 76,7% à un grossissement de 5x et de 91,5% à un grossissement de 0,5x (Fig. 3). Comparé à la performance sur les images de l'aquascope du Greifensee, cela représente une baisse de la précision de 13,6% et 2,3% respectivement [11]. Au grossissement 5x, le classificateur a eu le plus de mal avec les diatomées pennées, Mallomonas, Aulacoseira et le zooplancton, alors qu'au grossissement 0,5x, il a souvent mal classé les peaux de daphnies et de copépodes ainsi que la saleté.
Dans l'ensemble, le classificateur existant peut traiter des images provenant d'un autre appareil, certains taxons étant moins performants que d'autres. Cela montre que le développement de classificateurs plus spécialisés, adaptés aux exigences spécifiques des projets, est possible avec un effort réduit et le soutien du classificateur du Greifensee.
Pour évaluer la performance de l'approche Aquascope par rapport aux méthodes traditionnelles, les comptages Aquascope et la microscopie traditionnelle ont été analysés. Il a d'abord fallu établir des données quantitatives absolues sur l'abondance des taxons planctoniques. Les deux grossissements ont des volumes d'imagerie différents, en fonction de la profondeur de champ des objectifs. La différence théorique de volume est de 20 (5 × = 0,2-10 μl, 0,5 × = 4-200 μl). Le grossissement 0,5 fois a permis de détecter 23 fois plus de ROI Asterionella (taxon représenté aux deux grossissements) que le grossissement 5 fois. On pourrait diviser le ROI/sec du grossissement 0,5x par 23 afin d'obtenir une estimation d'abondance cohérente pour les deux grossissements. Alternativement, on pourrait convertir les ROI/sec en cellules/ml, en se basant sur l'étalonnage dans Merz et al. [3]. On peut alors comparer les abondances dans les deux grossissements. Pour calculer les biomasses, la surface totale de chaque taxon peut être corrigée avec l'abondance correcte en cellules/ml.
La meilleure correspondance entre les données microscopiques et les données Aquascope a été trouvée pour la biomasse/l (microscopie, abondance relative au niveau de la souche) et la biosurface/l, basée sur la biosurface totale et les cellules/ml (étalonnage de Merz et al. [3]). Un modèle linéaire de la biomasse relative des souches a donné une pente de 0,65 et un R² ajusté de 0,37. L'ajustement imparfait du modèle pourrait être dû à des estimations imprécises de l'abondance ou à des erreurs de classification dans l'Aquascope. Alternativement, des imprécisions dans le calcul de la biomasse à partir de comptages microscopiques, où chaque taxon se voit attribuer une taille de cellule nominale, pourraient jouer un rôle.
L'Aquascope est capable d'identifier moins de taxons planctoniques que la microscopie traditionnelle. Par exemple, la caméra sous-estime l'abondance et la biomasse relatives de Ochrophyta par rapport à la microscopie. L'Aquascope nous permet de distinguer un total de sept taxons Ochrophyta, par rapport aux 17 taxons Ochrophyta régulièrement identifiés par comptage microscopique, ce qui pourrait indiquer une limite de taille de l'Aquascope.
Si l'on compare la perte d'informations à des niveaux taxonomiques plus fins (tableau 1), il apparaît clairement que les données de l'Aquascope perdent considérablement plus d'informations détaillées au niveau des espèces que les données microscopiques, qui sont enregistrées avec une résolution plus élevée. Par exemple, la perte d'informations au niveau de l'ordre est de 60,76% pour les données Aquascope, alors qu'elle n'est que de 12,54% pour les données microscopiques. De plus, plus la résolution taxonomique est fine, plus la concordance entre les données des deux méthodes diminue, ce qui limite la capacité de l'Aquascope à fournir des informations taxonomiques détaillées. Ainsi, l'Aquascope est mieux adapté à une surveillance à grande échelle des écosystèmes lacustres, alors qu'il perd en précision lorsqu'il s'agit de la composition détaillée des espèces.
| Niveau taxonomique | Pente | P | R2 ajusté | % NA dans les données Aquascope | % NA dans les données microscopiques |
| Souche | 0,6473 | 0,012 | 0,3735 | 0 | 0 |
| Classe | 0,6507 | 0,0001 | 0,5257 | 0,2287 | 0 |
| Ordre | 0,1942 | 0,0591 | 0,0704 | 0,6076 | 0,1254 |
| Famille | 0,188 | 0,0149 | 0,1179 | 0,7524 | 0,1725 |
En juillet 2023, l'Aquascope identifie 29 groupes taxonomiques de phytoplancton et 29 de zooplancton dans chacun de ses deux grossissements. La microscopie traditionnelle, en revanche, permet aux spécialistes taxonomiques formés de distinguer une centaine de groupes, souvent jusqu'au niveau du genre ou de l'espèce. D'autres méthodes d'imagerie, comme la FlowCam, présentent également des limites similaires. Ainsi, Alvarez et al. [14] ont pu identifier 34 groupes avec la FlowCam, tandis qu'un spécialiste a reconnu 144 groupes sous le microscope [4]. La plupart des cantons communiquent toutefois l'abondance et la biomasse au niveau des souches ou des classes (p. ex. BE : [14] ; AG : [15] ; ZH : [16]). L'utilisation de l'imagerie pourrait prolonger ces séries temporelles si, dans de futurs projets, le benchmarking de l'approche Aquascope par rapport à l'échantillonnage traditionnel se poursuivait sur plusieurs années.
Il est difficile de démêler les facteurs qui influencent les différences d'abondance relative des groupes taxonomiques entre la microscopie traditionnelle et les techniques d'imagerie automatisées comme l'Aquascope, car chaque approche a ses biais intrinsèques. Parmi ces facteurs, on peut citer : La stochasticité de l'échantillonnage ou du sous-échantillonnage utilisé pour le comptage microscopique (ainsi que l'aquascope), les différences et les incertitudes dans l'attribution de la biomasse aux individus comptés, et bien d'autres choses encore.
Par conséquent, davantage de benchmarking est nécessaire pour valider les données de surveillance basées sur l'imagerie et les données microscopiques traditionnelles. Les résultats de comparaisons supplémentaires mettront probablement en évidence que chaque approche présente des avantages par rapport à l'autre et des limitations inhérentes. Le choix d'une méthode plutôt qu'une autre peut dépendre des objectifs et des exigences du programme de surveillance.
En résumé, les techniques d'imagerie automatisées peuvent accélérer considérablement le processus de surveillance par rapport à la microscopie traditionnelle et la méthodologie peut être standardisée dans tous les laboratoires. De plus, le traitement d'un échantillon ne dépend pas de la disponibilité d'un professionnel formé et expérimenté, ce qui sera le facteur limitant à l'avenir. Dans l'ensemble, les techniques d'imagerie automatisée sont des outils puissants qui représentent un compromis entre i) la traçabilité, la standardisation, la rapidité et l'indépendance par rapport à des spécialistes taxonomiques formés et ii) la résolution taxonomique et la perspicacité d'un expert.
Les auteurs montrent qu'avec un projet de benchmarking de plus grande envergure (valable pour l'Aquascope et la FlowCam), il pourrait être possible d'intégrer le suivi traditionnel et à long terme des séries temporelles avec l'imagerie automatisée. Cette dernière est même capable de fournir des données peu coûteuses et fiables sur la biodiversité planctonique à un niveau taxonomique approximatif, mais qui devrait être suffisant pour les rapports sur la qualité de l'eau et l'état de l'écosystème par de nombreuses autorités cantonales.
[1] OFEV (2023) : Qualité de l'eau des lacs. Etat des eaux en 2022.
[2] Niederhauser, P. (2023) : Concept d'analyse des eaux de surface Période de mesure 2022 à 2025
[3] Merz, E. et al. (2021) : Underwater dual-magnification imaging for automated lake plankton monitoring. Water Res ; 203:117524
[4] Álvarez, E. et al. (2013) : Détermination en routine de la composition de la communauté planctonique et de la structure en taille : une comparaison entre la FlowCAM et la microscopie optique. J Plankton Res ; 36:170-84
[5] Rivas-Villar, D. et al. (2021) : Fully automatic detection and classification of phytoplankton specimens in digital microscopy images. Comput Methods Programs Biomed ; 200:105923
[6] Rivas-Villar, D. et al. (2020) : Détection automatique de spécimens de phytoplancton d'eau douce dans des images de microscopie conventionnelle. Sensors ; 20.
[7] Lombard, F. et al. (2019) : Observations quantitatives globalement cohérentes des écosystèmes planctoniques. Frontiers in Marine Science ; 6.
[8] Yokogawa Fluid Imaging Technologies, Inc. FlowCam 8000 Series. Fluidimaging.com n.d.
[9] Roberts, P. SPCConvert. Github ; n.d.
[10] Orenstein, E.C. et al. (2020) : The Scripps Plankton Camera system : A framework and platform for in situ microscopy. Limnol. Oceanogr. Methods ; 18:681-95
[11] Kyathanahally ,S.P. Plankiformer. Github ; n.d.
[12] Plankifier. Github ; n.d.
[13] Merkli, S. et al. (2024) : Application en laboratoire de l'approche Aquascope d'imagerie et de classification automatisées pour le suivi à long terme du plancton. BioRxiv : 2024.02.23.581739.
[14] Guthruf, K. et al. (2020) : Entwicklung des Phyto- und Crustaceenplankton / Le développement du phytoplancton et du plancton de crustacés 2019
[15] Canton d'Argovie : Etat du lac de Hallwil. Eaux de surface n.d.
[16] Niederhauser, P. et al. (2023) : L'eau et les milieux aquatiques 2022 - Rapport principal
Résumé
Les auteurs remercient les cantons d'Argovie, de Berne, de Lucerne, de Fribourg, de Neuchâtel, de Vaud et de Zurich ainsi que le VSA pour le financement du projet et pour les précieux échanges.
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