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Die weltweite Zunahme von antibiotikaresistenten Erregern ist aktuell und in der absehbaren Zukunft ein Thema mit hoher medizinischer Brisanz und gesellschaftlicher Relevanz (Box). Dank der allgemein guten Rohwasserqualität und einer Qualitätssicherung auf hohem Niveau ist das Trinkwasser in der Schweiz eher kein relevanter Ausbreitungsweg für Antibiotikaresistenzen, wie frühere Studien zeigen konnten [1]. Aber die Zunahme anthropogener Aktivitäten, einschliesslich Ackerbau, Viehhaltung, fortschreitender Zersiedelung sowie Einleitung von gereinigtem und ungereinigtem (z. B. durch Regenwasserentlastungen) Abwasser in die Oberflächengewässer, kann auch hier zu Beeinträchtigungen der Trinkwasserressourcen führen. Im Gegensatz zu chemischen Belastungen, die dank der «Initiative für sauberes Trinkwasser» und der «Initiative für eine Schweiz ohne synthetische Pestizide» auch in der öffentlichen Diskussion sehr präsent gewesen sind, wird die einwandfreie mikrobiologische Qualität des Trinkwassers in der Schweiz meist als selbstverständlich vorausgesetzt.
StAR
2015 wurde die Nationale Strategie Antibiotikaresistenzen (StAR) lanciert. Sie zeigt auf, wo in der Schweiz Handlungsbedarf besteht, welche Ziele erreicht werden sollen und welche Massnahmen für die Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen nötig sind. Eine der zentralen Massnahmen ist der Ausbau der Datenerhebung.Trinkwasser in einwandfreier Qualität zur Verfügung zu stellen ist eines der zentralen Anliegen der Schweizer Trinkwasserversorger und ihres Fachverbandes SVGW (Schweizerischer Verein des Gas- und Wasserfaches). Zudem sorgen in der Schweiz und in Europa strenge Normen für die Sicherheit des Trinkwassers. Tatsächlich hat in der Schweiz das Trinkwasser sogar ein Qualitätsniveau, das mit dem von Mineralwasser konkurrieren kann [2]. Dennoch sind die Trinkwasserversorger der Schweiz herausgefordert, das Thema Antibiotikaresistenzen im Blick zu behalten, um gegebenenfalls Bedenken hinsichtlich der Rolle des Trinkwassers bei der Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen bewerten zu können.
Ein Monitoring des Vorkommens von Indikatoren für Antibiotikaresistenzen mit molekularbiologischen Methoden (z. B. Nachweis von Resistenzgenen mit quantitativer PCR) ist möglich und wurde in der Schweiz im Labor der Trinkwasserversorgung Zürich auch bereits durchgeführt. Allerdings sind diese Monitoringmethoden aufwendig und teuer. Da akute Gesundheitsrisiken durch Antibiotikaresistenzen im Trinkwasser nicht belegt sind, ist ein breiter Einsatz aktuell kaum zu rechtfertigen.
Unter anderem stellt sich daher die Frage, inwieweit auch bereits im Einsatz befindliche Routinemethoden mit Informationen über Antibiotikaresistenzen verknüpft werden können. Eine der neueren Methoden des Trinkwassermonitorings ist die Durchflusszytometrie (flow cytometry, FCM). Derzeit findet sie zunehmend Verbreitung. Eines der Bewertungskriterien, das dabei zur Anwendung kommt, ist die Bestimmung des Anteils sogenannter «High Nucleic Acid»-(HNA-) gegenüber «Low Nucleic Acid»-(LNA-)Bakterien [3]. Diese Bakteriengruppen, die sich anhand ihrer durchflusszytometrischen Eigenschaften kategorisieren lassen, unterscheiden sich durch ihren Nukleinsäuregehalt und ihre Grösse [3]. An der Eawag wurden in Flusswasser- und Abwasserproben Beobachtungen gemacht, die zur Hypothese führten, dass Antibiotikaresistenzen sehr deutlich in den HNA angereichert sind. Aufgrund dieser vorläufigen Ergebnisse wurde mit Unterstützung des Forschungsfonds Wasser (FOWA) des SVGW von der Eawag ein Forschungsprojekt durchgeführt, das zum Ziel hatte, diese Hypothese durch weitere Messungen an Proben mit Relevanz für die Trinkwasserversorgung (also Roh- bis Leitungswasser verschiedener Trinkwasserversorgungen) zu überprüfen.
Realisiert wurde die aktuelle Studie 2020 in Zusammenarbeit mit sechs Schweizer Trinkwasserversorgern. An jedem Standort wurden Proben von Rohwasser, von Trinkwasser nach der Aufbereitung und von Netzwasser entnommen (Tab. 1).
Zur Gewinnung der bakteriellen Biomasse und für die Unterteilung in HNA- und LNA-Fraktionen wurden Membranfilter verwendet. Für die Gesamtfraktion wurden Proben direkt durch Membranfilter mit 0,2 µm Porengrösse filtriert. Wie bereits durch wissenschaftliche Studien gezeigt wurde, kann mithilfe von Filtration durch Membranfilter mit 0,45 µm Porengrösse eine Grössenfraktionierung der Bakterien erreicht werden, welche weitgehend den mittels Durchflusszytometrie identifizierten HNA- und LNA-Clustern entspricht [3]. Die HNA-Fraktion verblieb direkt auf dem 0,45-µm-Filter; das Filtrat wurde zur Gewinnung der LNA-Fraktion nochmals durch Membranfilter mit 0,2 µm Porengrösse filtriert. Anschliessend wurde aus den Filtern die DNA (Erbsubstanz) der Zellen extrahiert und aufgereinigt. An den DNA-Extrakten der verschiedenen Fraktionen wurde daraufhin mittels quantitativer PCR das Vorhandensein und die Häufigkeit von zwei Marker-Genen für Antibiotikaresistenz bestimmt: das Sulfonamid-Resistenzgen sul1 und das Integron-Integrase-Gen intI1. Beide sind häufig mit klinisch relevanten Mehrfachresistenzen assoziiert. Um ein Inventar aller Antibiotikaresistenzgene (ARG) in den Proben zu erstellen (Resistom-Analyse), wurden ausgewählte Proben ausserdem metagenomisch analysiert. Metagenomik bezeichnet ein Verfahren, bei dem der gesamte genetische Code in einer DNA-Probe gelesen wird (Fig. 1).
Bei der Probennahme sollte ein möglichst repräsentativer Querschnitt von unterschiedlichen Rohwasserqualitäten und Aufbereitungsverfahren (Tab. 1) berücksichtigt werden. Die Wasserproben sowie das Filtrat nach der 0,45-µm-Filtration wurden mittels Durchflusszytometrie (SYBR-Green-Methode) charakterisiert und der Anteil intakter Zellen (Lebendzellzahl) der HNA- und LNA-Bakterien bestimmt (SYBR-Green- u. Propidium-Iodid-Färbung). Die Gesamtkeimzahlen in den untersuchten Wasserproben variierten gemäss FCM über mehrere Grössenordnungen zwischen ca. 5 × 102 und 5 × 106 Zellen/ml (Fig. 2).
Die höchsten Zellzahlen wurden dabei erwartungsgemäss in Oberflächenwasserproben gemessen. Die Zahl intakter (lebender) Zellen lag in den meisten Proben zwischen 60 und 80% der Gesamtzellzahl (Fig. 2). Im ozonierten Trinkwasser aus Betrieb C1 (C1-2 und C1-3) wurden deutlich niedrigere Anteile von intakten Zellen gemessen (15 und 7% der Gesamtzellzahl).
Der Anteil der HNA variierte in den untersuchten Proben stark, zwischen 9 und 87%. Hohe HNA-Anteile wurden vor allem in Fluss-, See- und Rohwasserproben gefunden. Eine Ausnahme stellte das Oberflächenwasser C1-1 dar, das einen sehr hohen Anteil an LNA aufwies. Das Ziel, Wasserproben mit unterschiedlichen mikrobiologischen Eigenschaften zu beproben, wurde demnach erreicht.
Nach der Filtration durch die 0,45-µm-Membran (zur Fraktionierung der HNA und LNA) war der LNA-Anteil im Filtrat deutlich angereichert und betrug im Mittel 90 ± 5%. Dass die Filtrationsmethode nicht zu 100% trennscharf ist, ist bekannt [3]. Umgekehrt muss man auch mit einem Anteil von LNA-Bakterien rechnen, der zusammen mit den HNA auf dem 0,45-µm-Filter verbleibt. Für die Zwecke dieser Untersuchung wurde die Anreicherung nach der Filtrationsmethode aber als ausreichend angesehen.
Etliche der untersuchten Wasserproben, insbesondere Grundwasser- und Netzwasserproben, weisen geringe Zelldichten auf (Fig. 2). Dies stellt auch eine Herausforderung für die weitere molekularbiologische Analyse dar, da nur geringe Mengen DNA aus den Proben gewonnen werden konnten. Zudem sind Antibiotikaresistenzgene in diesen Wasserproben rar (bspw. im Gegensatz zu Abwasser, vergl. [4]). Daher wurden die Analysen für zwei Gene (sul1 und intI1) durchgeführt, die erfahrungsgemäss vergleichsweise häufig vorkommen, aber dennoch als gute Indikatoren für das Vorkommen von erworbenen Antibiotika- und auch Mehrfachresistenzen gelten [5].
Dennoch war die Häufigkeit des sul1-Antibiotikaresistenzgens und des Indikatorgens intI1 in den untersuchten Wasserproben insgesamt gering. In etlichen Proben blieb sie unterhalb der Nachweis- oder der Quantifizierungsgrenze der quantitativen PCR-Methodik, wobei der Nachweis von intI1 in mehr Proben gelang als bei sul1 (Fig. 3). Gleichwohl zeigt die Abbildung klar, dass in Proben, für die ein Gen quantifizierbar ist, die HNA- und die Gesamtfraktionen eine sehr ähnliche Häufigkeit aufweisen. In mehreren Proben konnte sul1 oder intI1 in der Gesamt- und der HNA-Fraktion quantifiziert werden, war aber in der LNA-Fraktion der jeweiligen Probe nicht quantifizier- oder nicht detektierbar. Das sul1-Gen war in der LNA-Fraktion nur in drei Proben quantifizierbar, das intI1-Gen in sechs. In diesen Proben lag die Häufigkeit der Gene in der LNA-Fraktion jeweils deutlich unter 0,5% der Häufigkeit in der HNA-Fraktion.
Diese Resultate deuten bereits auf eine Assoziation der Resistenzmarker mit der HNA-Fraktion hin. Allerdings muss für eine gründliche Betrachtung die bakterielle Häufigkeit in der HNA- und LNA-Fraktion mitberücksichtigt werden.
Durch Normalisierung der Häufigkeit der Resistenzindikatorgene gegen die Häufigkeit eines Marker-Gens für die gesamte bakterielle Population (verwendet wird hierzu das Gen für 16S ribosomale RNA, das in allen Bakterien vorhanden ist) erhält man ein Mass für die relative Häufigkeit des Resistenzmerkmals in der bakteriellen Population jeder Probe. Alternativ kann die relative Häufigkeit auch durch Normalisierung auf die mittels Duchflusszytometrie gemessene Zellzahl in der Probe berechnet werden. Mit diesen Werten lässt sich wiederum ein Anreicherungsfaktor für die Resistenzmarker in der HNA-Fraktion bestimmen, allerdings nur für die Proben, für welche Werte sowohl von der HNA- wie auch von der LNA-Fraktion vorhanden sind.
Für das intI1-Gen stellen wir fest, dass diese relative Häufigkeit in der HNA-Fraktion immer deutlich höher ist (Tab. 2). Die relative Häufigkeit (16S-normalisiert) in der HNA-Fraktion war dabei um einen Faktor von 1,6 bis 360 höher als in der LNA-Fraktion derselben Probe (RA-Faktor, Tab. 2). Wird auf FCM normalisiert, war sie in der HNA-Fraktion sogar um einen Faktor von 6 bis 2500 höher. Für sul1 fallen die Unterschiede insgesamt weniger dramatisch aus, wobei auch hier die relative Häufigkeit (16S) des Resistenzgens in der HNA-Population um einen Faktor von 1,2 bis 3,4 höher ist als in der LNA-Fraktion. Bei FCM-normalisierten Häufigkeiten war sie 10- bis 90-mal höher (Tab. 3).
Da die quantifizierte Häufigkeit von sul1 in der LNA-Fraktion immer sehr gering war, ist es möglich, dass diese Werte mit einem grösseren relativen Fehler behaftet sind. Insbesondere ist bei der Interpretation auch die durch Filtration nicht ganz vollständige Trennung von HNA und LNA in Betracht zu ziehen. Eine gewisse Verunreinigung durch die jeweils andere Fraktion tritt sowohl bei der HNA- wie auch bei der LNA-Fraktion auf. Unter der Annahme, dass die Resistenzmarker in der HNA-Fraktion in der Tat häufiger vorkommen (was durch die erhaltenen Ergebnisse qualitativ gut belegt ist), führen diese Kontaminationen insgesamt zu einer Unterschätzung der Anreicherungsfaktoren. In Wahrheit liegen die Anreicherungsfaktoren also vermutlich höher als in Tabelle 2 und 3 angegeben.
An ausgewählten Proben haben wir eine metagenomische Sequenzierung des Genmaterials der Bakteriengemeinschaft durchgeführt. Anschliessend wurde diese genetische Information mit Datenbanken von Antibiotikaresistenzgenen verglichen und so der Gehalt an Antibiotikaresistenzgenen (das sogenannte Resistom) in der Bakteriengemeinschaft bestimmt. Diese Antibiotikaresistenzgene wurden anschliessend anhand ihrer Resistenzwirkung gegen verschiedene Wirkstoffklassen zusammengefasst und gegen den Gehalt an 16S-Genen normalisiert (Fig. 4). Die Resistom-Analyse offenbarte, dass Resistenzmechanismen gegen diverse Antibiotikaklassen in den Wasserproben nachgewiesen werden konnten, auch in den Netzwasserproben A-4, D-4 und C-4 (Fig. 4). ARG gegen MLS (Macrolid-, Lincosamid-, Streptogramin-Antibiotika), Aminoglycoside, Fosmidomycin, Nitroimidazol und Peptid-Antibiotika wurden in den meisten Proben und meist in höherer Häufigkeit identifiziert. Die von uns auch als Resistenzmarker für quantitative PCR (sul1) verwendete Sulfonamidresistenz wurde dagegen nur mit geringer Häufigkeit nachgewiesen (max. 8 per Mille, A-4). Dies zeigt, dass es durchaus Resistenzen gibt, die häufiger vorkommen als das von uns verwendete Indikatorgen.
In der HNA-Fraktion wurden jeweils Resistenzen gegen mehr verschiedene Wirkstoffklassen gefunden als in der LNA-Fraktion der gleichen Probe (ausser bei LSP 2, hier hatten beide Fraktionen die gleiche Anzahl). Auch war die aufsummierte relative Häufigkeit der Resistenzgene insgesamt jeweils niedriger (Fig. 4). Besonders ausgeprägt war dies im Netzwasser. Diese Tendenz trifft in den meisten Fällen auch für die einzelnen Wirkstoffkategorien zu: Für fünf Resistenzklassen waren die Mittelwerte in der HNA-Fraktion statistisch signifikant höher als in der LNA-Fraktion (paarweiser t-Test, p < 0,05; Tab. 4). Gemittelt über alle paarweisen Verhältnisse der relativen Häufigkeit aller Resistenzklassen, war die relative Häufigkeit in der HNA-Fraktion um den Faktor 11 höher als in der LNA-Fraktion (Median 2,3). Im paarweisen Vergleich war in 68 von 100 Fällen die relative Häufigkeit in der HNA-Fraktion höher (in 23 davon keine Detektion in der LNA-Fraktion). Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass die beobachteten Resistenzen in der LNA-Fraktion grösstenteils auf die Kontamination mit HNA zurückgehen, auch wenn sich das mit den vorhandenen Daten nicht abschliessend belegen lässt.
Die Resultate stützen damit insgesamt klar die Hypothese, dass Resistenzen in erster Linie in den HNA vorhanden sind. Vorherige Studien hatten gezeigt, dass LNA sich in der Artenzusammensetzung klar von den HNA unterscheiden [3]. Unter den LNA finden sich viele Arten mit reduziertem Genom, die vermutlich sehr spezifisch an bestimmte ökologische Nischen in der Umwelt angepasst sind. Auch symbiontische Lebensformen finden sich darunter und viele Arten, die noch gar nicht im Labor kultiviert werden konnten [3]. Solche Lebensformen stehen wahrscheinlich unter erhöhtem ökologischem Druck, alle nicht unbedingt benötigten Funktionen, wie z. B. Antibiotikaresistenzen, aus ihrem Genom zu entfernen. Dagegen finden sich unter den HNA viele Arten, die engere Verwandtschaftsbeziehungen zu menschlichen Kommensalen und Krankheitserregern haben. Damit kommen sie eher für einen Gentransfer infrage und können auch eher von der Fähigkeit zur Antibiotikaresistenz profitieren.
Die Ergebnisse dieser Studie sollten nicht überinterpretiert werden. Zwar wurde gezeigt, dass Antibiotikaresistenzgene in erster Linie mit den HNA assoziiert sind. Das bedeutet im Umkehrschluss aber nicht, dass nun das Vorhandensein von HNA mit einer gefährlichen Kontamination durch antibiotikaresistente Bakterien gleichzusetzen ist. Die Risikobewertung von Antibiotikaresistenzgenen in Umweltbakterien ist sehr komplex und kann nicht anhand von stark vereinfachten Parametern durchgeführt werden. Vielmehr fügen sich unsere Resultate in das bereits vorhandene Bild von HNA als einer schnell wachsenden und, im Vergleich zu LNA, potenziell eher problematischeren Bakteriengruppe ein [6].
[1] Bürgmann, H.; Imminger, S. (2017): Antibiotikaresistenzen im Trinkwasser? Aqua & Gas 10, 60-66
[2] Blanc, P.; Schädler, B. (2014): Water in Switzerland — An Overview. Swiss Hydrological Commission, 28
[3] Proctor, C.R. et al. (2018): Phylogenetic clustering of small low nucleic acid-content bacteria across diverse freshwater ecosystems. The ISME Journal 12, 1344–1359, https://doi.org/10.1038/s41396-018-0070-8
[4] Lee, J. et al. (2021): Unraveling the riverine antibiotic resistome: The downstream fate of anthropogenic inputs. Water Research 197, 117050, https://doi.org/10.1016/j.watres.2021.117050
[5] Berendonk, T.U. et al. (2015): Tackling antibiotic resistance: the environmental framework. Nature Reviews Microbiology 13(5), 310-317, https://doi.org/10.1038/nrmicro3439
[6] Besmer M.D. et al. (2014): The feasibility of automated online flow cytometry for in-situ monitoring of microbial dynamics in aquatic ecosystems. Frontiers in Microbiology 5, 265, https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00265
Durchflusszytometrie
Eine Methode, bei der die optischen Eigenschaften von Partikeln in einem kapillaren Flüssigkeitsstrom gemessen und Partikel gezählt werden. Sie erlaubt im Zusammenspiel mit verschiedenen Färbemethoden die Bestimmung des Bakteriengehaltes einer Wasserprobe (Gesamtzellzahl) und, ob diese intakt/lebendig sind (Lebendzellzahl).
HNA – «High Nucleic Acid»-Bakterien
Eine diverse Gruppe von Bakterien, die durchflusszytometrisch bestimmt werden können und die sich durch grosse Zellen mit hohem DNA-Gehalt auszeichnen.
LNA – «Low Nucleic Acid»-Bakterien
Eine diverse Gruppe von Bakterien, die durchflusszytometrisch bestimmt werden können und die sich durch kleine Zellen mit geringem DNA-Gehalt auszeichnen.
Quantitative PCR (qPCR)
Eine molekularbiologische Methode, bei der mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) die Anzahl der Kopien eines vorgegebenen Gens in einer Probe bestimmt wird.
Antibiotikaresistenzgen
Ein Gen, das die genetische Eigenschaft für eine bestimmte Antibiotikaresistenz codiert.
sul1
Ein Antibiotikaresistenzgen, das Resistenz gegen Sulfonamid-Antibiotika verleiht. Es kommt häufig gemeinsam mit anderen Resistenzgenen in «Integrons» genannten genetischen Strukturen vor, in die sich verschiedene Gene einlagern können und die manchmal von einem Bakterium an ein anderes weitergegeben werden.
intI1
Das sogenannte «Integron-Integrase»-Gen ist notwendiger Bestandteil der oben beschriebenen Integron-Strukturen und daher, wie sul1, ein guter Indikator für übertragbare, mehrfache Antibiotikaresistenzen.
Resistom
Die Summe aller Antibiotikaresistenzgene in einer Bakteriengemeinschaft.
Metagenomik
Eine Methode, bei welcher der genetische Code einer ganzen Bakteriengemeinschaft durch Sequenzierung bestimmt wird.
Sequenzierung
Eine Methode, um den genetischen Code eines DNA-Moleküls auszulesen.
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